微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

每次试验中的藻类试验液必须来自同一个贮备培养物。已经在以前的毒性试验中使用过的培养物不得再次使用。
（5）设定平行和对照
正式试验中每个试验液浓度至少要设置三个平行样，每一系列设两个对照样。也可根据需要增加浓度或减少平行的数量。
当使用助溶剂增加受试物的溶解度时，对照组中助溶剂应与测试液中助溶剂浓度最高时一致。
试验操作
（1） 预试验（确定浓度范围试验）
为确定正式试验中受试物的浓度范围，可以先进行一次预试验。
预试验的浓度可按对数间距排布，最低浓度应为受试物的检测下限，最高浓度应为饱和浓度。无需设平行样。测定项目个方法可简化，实验时间也可缩短。
如果预试验中在最高浓度测点，藻的生长抑制低于50%，或者在最低浓度测点中藻的生长抑制高于50%，可不必再进行正式试验。
如果有必要进行正式试验，可根据与试验的结果确定正式试验是受试物的浓度范围和浓度间距。
（2） 异溶于水的化学物质的正式试验
① 受试物试验液：用经过0.45μm 滤膜过滤后的培养基配制受试化学品的贮备液，其浓度为测试时所需最高浓度的二倍。
用此贮备液稀释配制成一系列不同浓度的受试物试验液，其浓度也分别为测试时所需浓度的二倍。试验浓度可按10，n/10 或10 年/2 的几何级数或等对数间距设计。
试验前应测定受试验液的pH 值，必要使用HCl 或NaOH 液将pH 调整为7.5±0.2。
试验结束时应测定受试物的浓度。
② 藻试验液：藻试验液是用于进行试验的藻培养物，对藻类进行预培养后，镜检其生长情况，并计数细胞浓度。然后用培养基稀释至藻细胞浓度为2*104 个/ml，即成为可用于试验接种的藻试验液。
③ 测试液：测试液是正式用于测试的，含有藻试验液和受试物试验液的液体。
现在每个三角瓶（或其他培养容器）中加入50ml 藻试验液，然后再添加50ml 受试物试验液。
对照组瓶中不加受试物试验液而只添加50ml 培养基。将各瓶摇动均匀后放入培养装置，试验正式开始。
④ 藻类生长状况的测定：实验开始后，每隔24h，即在24、48、72h 时，从每个瓶中取样进行生长测定。测定项目包括藻类细胞浓度、光密度或叶绿素。最好同时测定前两项，如果工作量过大，也可只测定细胞浓度。当使用颗粒计数仪或分光光度以进行测定时，过滤得培养基分别作为背景和空白。试验开始和试验72h 后，应测定pH 值。试验期间溶液pH 偏差大于1 个单位是不正常的。
（3） 有限水溶性化学物质的正式试验
如果受试物的水溶性低于1000mg/L，试验操作应作如下修改：
①受试物试验液：用适当的溶剂制备受试物的贮备液，其浓度应使测试时所需最高浓度的104 倍。溶剂应对藻类生长无影响，并且在试验溶液中的含量最高不得超过100mg/L。
要设置助溶剂对照，其浓度应与试验液中助溶剂的最高浓度一致。
②藻类验液：用培养基将经过与培养的藻类培养物配制藻试验液，使细胞浓度为104 个/ml。
③测试液：每个三角瓶中加入100ml 藻种液，再添加10μl 溶剂。其他步骤同易水溶性化学品。
（4）挥发性化学物质的正式试验
目前，还没有被普遍接受的方法来测试挥发性物质。当已知一种物质有挥发倾向时，应使用密封的磨口烧瓶测试。应设法测定溶液中受试物的量，最后应说明以挥发性化学品的测试结果是在密封系统中进行的。
（5）废水或环境水样的正式试验
当受试物为废水或环境水样时，水养必须密封、低温存放0-4oC。样品瓶中应充满水养不留空气，尽量使样品毒性变化较小，而且在试验前的保存时间越短越好。测试废水样品或环境水样之前要预先振摇。可直接用水样作为毒性试验液：如果水样毒性过大，也可使用稀释水配成适当浓度的试验液，对于含有难溶性毒物的水样，同时可以使用助溶剂或乳化剂。
如果水样所含毒物在一段时间内不稳定，必须定期分析。
废水的稀释液浓度可用体积百分比表示。
（6）藻类生长测定方法
测定藻类生长的指标和方法很多，本方法推荐采用以下测定方法：
①细胞计数：在显微镜下，用0.1ml 计数框或血球数板对藻细胞的数量计数。用计数框时可采用视野法，即对显微镜视野中的所有细胞计数。放大倍数40*10。每片至少计数10个视野，如果藻细胞密度小，则要适当增及计数视野。藻数按视野累加。每次计数（同一批取样的样品）应采用相同方法（视野数目、放大倍数等）。
每一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15%，应予重新计数。如工作量过大，可先取样，用鲁哥氏液固定后保存，留待以后计数。镜检计数工作量较大，有条件时可采用电子颗粒计数仪。
②光密度：取一定量的测试液在分光光度计上测定其光密度，波长可选用650、663nm或其他波长，亦可用荧光光度计测定。
③叶绿素：样品经离心或过滤后，用丙酮、乙醇或其他溶剂萃取，进行分光测定，亦可用荧光光度计测定。
5.质量保证和质量控制
①本方法适用于多种淡水绿藻。
②本方法适用于水溶性且在试验条件下能保留在水中的物质。如果需要适用助溶剂（有机溶剂）来获得所要求的浓度，该助溶剂在水中的浓度不得超过100mg/L，适用乳化剂或分散剂时，其浓度应不影响光透性。