微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

表5-4-3 鉴别性致突变物在平板掺入法中试验结果 

注：表中回变菌落数取自于剂量反应曲线的线性部分，并已扣去了对照值。
4）菌株保存：
①鉴定合格的菌种应加入DMSO 作为冷冻保护剂，保存在-80℃或液氮（-196℃），或者冰冻干燥制成干粉，4℃保存。
②主平板保存：作主平板保存时，将菌落划线接种于主平板上，孵育24h 后保存于4℃冰箱中。TA97、TA98、TA100 菌株保存在氨芐青霉素主平板上，可使用二个月。TA102 菌株的氨芐青霉素-四环素住平板上，可保存二周。应按时从保存的主平板上移菌，制备新的主平板。
（6）实验程序
1）实验设计：受试物最低剂量为每平皿0.1μg，最高剂量为5mg，或出现沉淀的剂量。
或对细菌产生最小毒性剂量。一般选用4-5 个剂量，进行剂量-反应关系研究，每个剂量应由三个平行板。容积可选用用、二甲基亚砜（每皿不超过0.4ml）或其他溶剂。每次试验应有同时进行的阳性对照和阴性（溶剂）对照。
2）方法和步骤：试验方法有平板掺入法和点试法。一般先用点试法作预试验，以了解受试物对沙门氏菌的毒性个可能的致突变性，平板掺入法是标准试验方法。
①平板掺入法：在底层培养平皿上写上记号。取已融化在45oC 水浴中保温的顶层培养基一管（2ml）,依次加入受试物溶液0.1ml，测试菌菌液0.05-0.2ml（需活化时加10%S-9混合液0.5ml），迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上。
平放固化后，将平板翻转，置37oC 培养48h 观察结果。
②点试法：在底层培养平皿上写上记号。取已融化并在45oC 水浴中保温的顶层培养基一管（2ml），加入测试菌菌液0.05-0.2ml（需活化时加10%S-9 混合液0.5ml），迅速混匀，倒在底层培养基上，倾斜平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化。取无菌滤纸圆片（直径6mm），小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10μl），点在纸片上，或将少量固体受试物洁净夹道智商或琼脂表面，将平板翻转，置37℃培养48h 观察结果。
6.质量保证
应对水养预处理和鼠伤寒沙门氏菌致突变试验进行质量控制。
①设置阴性对照，即用纯水代替水样，完成后样品制备全过程。用所得浓缩物作为阴性溶剂对照。
②设置阳性对照，用适当剂量的阳性对照物经历样品制备全过程。
③致突变试验标准菌株应鉴定合格，试验应设置平行样。
7.数据与报告
（1）数据处理
结果以均数±标准差表达。利用适当的统计学方法处理数据了。
（2）结果评价
①点试法：凡在点样纸片周围长出一圈密集的his+回变菌落者，该受试物即为诱变剂，如只在平板上出现少数散在的自发回变菌落。则为阴性，如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明受试物具有细菌毒性。
②掺入法计数培养基上的会变菌落数。如在背景生长良好条件下，受试物每皿回变菌落数等于或大于阴性对照数的2 倍，并有剂量-反应关系：或至少某一测试点有重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物对鼠伤寒沙门氏菌有致突变性。当受试物浓度达到抑菌浓度或5ml/皿仍为阳性者，可认为是阴性。
③报告的试验结果应是两次以上独立试验的重复结果。如果受试物对四种菌株（加和不加S-9）的平民掺入试验均得到阴性结果，可认为此受试物对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。
如受试物对一种或多种菌株（加或不加S-9）的平皿掺入试验得到阳性结果，即认为此受试物是鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
（3）试验的解释和评价
①细菌回复突变试验利用原核细胞，在某些方面不同于哺乳动物细胞，如摄取、代谢、染色体结构和DNA 修复过程。本试验的体外代谢活化系统不可能完全模拟哺乳动物体内代谢条件。因此本试验对受试物在哺乳动物致突变性和致癌强度不提供直接的资料。
②虽然本试验为阳性结果的化合物很多是哺乳动物致癌物，但其相关并不是绝对的，取决于化学物类别。有些在本试验未能见出阳性结果的致癌物，是因为经非遗传毒性机制或细菌缺乏的机制引起致癌作用的。
③本试验通常用于遗传毒性的初步筛选，并且，特别是用于诱发点突变的筛选。已有的数据库证明在本试验为阳性结果的很多化学物在其他试验也显示致突变活性，也有一些诱变剂在本试验不能检测，这可能是由于检测重点的特殊性、代谢活化的差别等。另一方面，增强本试验的敏感性可能导致高估了受试物的致突变活性。
（4）试验报告
试验报告必须包括下列资料。
①受试物：水样采集地点，采样日期和时间，气象条件，水样外观，水样预处理方法和过程，受试物浓度。
②溶剂/赋形剂：溶剂/赋形剂选择依据：受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。
③菌株：所用菌株；每个培养物细胞数；菌株特性。
④试验条件：每平板受试物的量（mg/平板或μl/平板），剂量选择的依据，每个剂量的平板数；所用培养基；代谢活化系统的种类和组成，包括合格的标准；处理方法。