微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

温度：与试验鱼种相适宜；
溶解氧浓度：高于空气饱和值的80%；
喂养：每周三次或每天投食，至试验开始前24h 为止。
②驯养开始48h 后，记录死亡率，并按下列标准处理：
7d 内死亡率小于5%，可用于试验；死亡率在5%-10%之间，继续驯养7d 死亡率超过10%，该组鱼全部不能使用。
（2）试验用水
使用高质量的自然水或标准稀释水，也可以使用饮用水（必要时应除氯）。水的总硬度为10-250mg/L(以CaCO3 计)，pH 为6.0-8.5。
（3）标准稀释水的配制
配制标准稀释水，所用试剂必须是分析纯，用全玻璃蒸馏水或去离子水配制。
①氯化钙溶液：将11.76g CaCl2•2H2O 溶解于水中，稀释至1L。
②硫酸镁溶液：将4.93g MgSO4•7H2O 溶解于水中，稀释至1L。
③碳酸氢钠溶液：将2.59g NaHCO3 溶解于水中，稀释至1L。
④氯化钾溶液：将0.23g KCl 溶解于水中，稀释至1L。
蒸馏水或去离子水的电导率应≤10Μs/cm。
将这四种溶液各25ml 加以混合并用水稀释至1L。溶液中钙离子和镁离子的总和是2.5mmol/L。Ca：Mg 的比例为4：1，Na：K 比为10：1。
稀释用水需经曝气直到氧饱和为止，储存备用。使用时不必再曝气。
（4）试验溶液
①将受试物贮备液稀释成一定浓度的受试物溶液。低水溶性物质的贮备液可以通过超声分散或其他适合的物理方法配制，必须时可以使用对鱼毒性低的有机溶剂、乳化剂和分散剂来助溶。使用这些物质时应加设溶剂对照组，其助溶剂含量应为试验组使用助溶剂的最高浓度，且不得超过100mg/L 或0.1ml/L。
②不需调节试验溶液的pH。如果加入受试物后水箱内水的pH 有明显变化，建议加入前，调节受试物贮备液的pH，使其接近水箱内水的pH。调节贮备液的pH 时不能使受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。最好使用HCl 和NaOH 来调节。
（5）暴露条件
时间：96h。
承载量：静态和半静态试验系统最大承载量为1.0g 鱼/L，流水式试验系统承载量可高一些。
光照：每天12-16h。
温度：与试验鱼种相适宜（见表 5-3-4），温控范围±2℃，对于较严格的试验温控±1℃范围。
溶解氧：不低于空气饱和值的60%，曝气时不能使受试物明显受损。
不喂食，并避免会改变鱼行为的干扰。
试验操作
在试验之前，应根据受试物的化学稳定性确定采用的试验方法，即静态、半静态和流水式试验，从而选定需用的容器和装置。
（1）预试验
用以确定正式试验所需浓度范围，可选择较大范围的浓度系列，如1000、100、10、1、0.1mg/L。每个浓度组放入五条鱼，可用静态方式进行，不设平行组，实验持续48-96h。每日至少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。
如果一次预试验结果无法确定正式试验所需的浓的范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。
（2）正式试验
根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和96h 鱼类全部存活的最高浓度之间至少应设置五个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应≤2.2。
每个试验浓度组应至少设三个平行，每一系列设一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照，其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。每一浓度组和对照组至少使用七尾鱼，条件允许的情况下，建议使用10 尾鱼。
试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随机取出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应在30min 内分组完毕。
在24h、48h、72h 和96h 后检查受试鱼的死亡状况，如果没有任何肉眼可见的运动，如腮的煽动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡，观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h 或6h 观察各处理组鱼的状况，并记录实验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡、游泳能力和呼吸功能减弱，色素沉积等）。
试验开始和结束时要测定pH 值、溶解氧和温度。试验期间，每天至少测定一次。
至少在试验开始和结束时，测定试验容器中试验液的受试物浓度。
应记录所观察到的亚致死效应。
（3）极限试验
在进行鱼类毒性测定时，可以进行浓度为100mg/L 的极限试验。如极限试验结果表明LC50＞100mg/L。可直接给出试验结果及评价：LC50＞100mg/L,属于低毒。极限试验至少使用七尾鱼，与对照自使用的鱼数目相等。
二项式理论表明：表明10 尾鱼，无一死亡。那么LC50＞100mg/L 的概率为99.9%；使用7-9 尾鱼，无一死亡，那么LC50＞100mg/L 的概率至少为99%。
如果试验与发生死亡，则应按本方法前述试验操作（1）、（2）的试验程序进行试验。
5.质量保证与质量控制
①试验结束时，对照组与死亡率不得超过10%。
②试验期间，试验溶液的溶解氧含量应＞60%的空气饱和值。
③试验期间，受试物实测浓度不能低于设置浓度的80%。如果试验期间受试物实测浓度与设置浓度相差超过20%，则以实测受试物浓度来表示试验结果。