微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

③有机物的大孔树脂分离提取：将净化后的树脂连同丙酮一起装入树脂柱，树脂上、下端分别垫、盖玻璃棉。排去柱中丙酮，用纯水洗柱三次（注意每次不能把试剂排空）。使水样流经树脂柱，流速为1~2 倍柱体积/min，水样量不超2000 倍柱体积，用真空泵抽去柱中水，然后用4~8 倍柱体积85：15 的正己烷、丙酮和8 个柱体积二氯甲烷分别三次浸柱以洗脱有机物。浸泡时间为每次10min。然后缓缓滴流，将洗脱液收集至烧瓶中。
④提取液浓缩：使用旋转蒸发器或KD 浓缩器，将获取的提取液或洗脱液浓缩。浓缩液50%供重量分析或化学分析，余50%继续浓缩至1ml。
⑤溶剂置换：于40℃水浴，用氮气将浓缩的提取液吹干。加入适量DMSO 溶解提取物，并稀释备用。
⑥样品量计算结果的表示：样品预处理所得水相体积或经树脂柱水样的体积以L 表示。有机提取物的重量以mg 表示。结果应换算至原水的水样量。
5.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
（1）仪器设备
洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸汽压力锅，匀浆器等实验室常用设备。低温高速离心机，低温水箱（-80℃）或液氮罐。
（2）培养基制备
除说明外，培养基成分或试剂应是化学纯或分析纯。避免重复高温处理，注意保存温度和期限。
1）营养肉汤培养基：用作增菌培养。
牛肉膏 2.5g
胰胨（或混合蛋白胨） 5.0g
氯化钠 2.5g
磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O） 1.3g
蒸馏水至 500ml
加热溶解，调pH 值为7.4，分装后0.103MPa 灭菌20min，4℃保存，保存期不超过6个月。
2）营养肉汤琼脂培养基：用作基因型（rfa 突变，R 因子，pAQ1 质粒，△uvrB）鉴定。
琼脂粉 1.5g
营养肉汤培养基 100ml
加热融化后调pH 值为7.4，0.103MPa 灭菌20min。
3）底层培养基，用于致突变试验。
①V—B 液贮备液，50×
磷酸氢钠铵（NaNH4HPO4） 17.5g
柠檬酸（C6H8O7•H2O） 10.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 50.0g
硫酸镁（MgSO4•7H2O） 1.0g
加蒸馏水至100ml，0.103MPa 灭菌20min。
待其他试剂完全溶解后，再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。
②40%葡萄糖溶液：
葡萄糖 40.0g
加蒸馏水至100ml，0.055MPa 灭菌20min。
③1.5%琼脂培养基：
琼脂粉 15g
蒸馏水 930ml
融化后0.103MPa 灭菌20min。趁热（80℃），以无菌操作加入：
V—B 盐贮备液50× 20ml
40%葡萄糖溶液 50ml
充分混匀，待凉至50℃左右时倒入培养皿，每皿（Φ90mm）25ml，37℃培养过夜，以除去水分及检查有无污染。
4）顶层培养基。
①顶层琼脂：
琼脂粉 0.6g
氯化钠 0.5g
加蒸馏水至100ml。0.103MPa 灭菌20min。
②0.5mmol/L 组氨酸—生物素溶液：
D—生物素（分子量244） 30.5mg
L—盐酸组氨酸（MW191.17） 23.9mg
加蒸馏水至250ml，0.103MPa 灭菌20min。
顶层培养基制备：加热融化顶层琼脂，每100ml 顶层琼脂中加0.5mmol/L 组氨酸—生物素溶液10ml。混匀，分装于灭菌试管，每管2ml，在45℃水浴中保温。
5）鉴定菌株基因型用试剂：
①0.8%氨苄青霉素溶液（无菌配制）：称取氨苄青霉素40mg，用0.02mol/L 氢氧化钠溶液5ml 溶解，保存于4℃冰箱。
②0.8%四环素溶液（无菌配制）：称取40mg 四环素，用0.02mol/L 盐酸5ml 溶解，保存也4℃冰箱。
③0.1%结晶紫溶液：称取结晶紫10mg，溶于10ml 灭菌蒸馏水。
④组氨酸—D—生物素板：
1.5%琼脂培养基 914ml
V—B 盐贮备液 20ml
40%葡萄糖溶液 50ml
L—盐酸组氨酸（0.4043g/100ml） 10ml
D—生物素溶液（0.02mol/L） 6ml 
分别灭菌后，全部合并（1000ml），充分混匀，待凉至50℃左右时倒平皿。
6）氨苄青霉素平板（保存TA97，TA98，TA100 菌株的主平板）；氨苄青霉素—四环素平板（保存TA102 菌株的主平板）。
1.5%琼脂培养基 914ml
V—B 盐贮备液 20ml
40%葡萄糖溶液 50ml
L—盐酸组氨酸（0.4043g/100ml） 10ml
D—生物素溶液（0.02mol/L） 6ml
0.8%氨苄青霉素溶液 3.15ml
0.8%四环素溶液 0.25ml(氨苄青霉素—四环素平板)分别灭菌或无菌制备，注入1000ml 瓶中，充分混匀，待凉至50℃左右时倒平皿。
（3）代谢活化系统的制备
1）大鼠肝S-9 的诱导和制备：选健康雄性成年SD 或Wister 大鼠，体重150g 左右，周龄5~6 周。将多氯联苯（Aroclor1254 或国产五氯联苯）溶于玉米油中，浓度为200mg/ml，按500mg/kg 体重一次腹腔注射，5d 后断头处死动物，取出肝脏称重后，用在4℃预冷的0.15mol/L 氯化钾溶液冲洗肝脏数次。每克肝（湿重）加预冷的0.15mol/L 氯化钾溶液3ml，用消毒后的医用剪刀剪碎肝脏，用匀浆器（低于4000r/min，1~2min）在冰浴中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部4℃冷环境。