微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

④试验期间，尽可能维持恒定条件。如果有必要，应使用半静态或流水式试验方式。
6.数据与报告
（1）数据处理
①已暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数-概率坐标纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出24h、48h、72h、96h 的LC50 值，并计算95%的置信限。
②如果试验数据不适于计算 LC50，可用不引起死亡的最好浓度和引起100%死亡的最低
死亡浓度估算LC50 的近似值，即这两个浓度的几何平均值。
（2）结果评价
鱼类急性毒性可按以下标准分级（表5-3-5）
表5-3-5 鱼类急性毒性分级标准 

（3）编写报告
试验报告应包括：实验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期，以及：
1）受试物质：对于化学品，其化学名称、其他名称（商品名等）、化学式、成分、制造厂商、批号、纯度等级和理化性质等；对于废水或环境样品，应给出其来源、采样时间、地点、保存条件等。
2）试验用鱼：实验用鱼名称、学名、品系、大小、来源、驯（养）化情况、试验开始时的鱼龄、规格等。 3）试验条件：
①使用的试验方式，如静态、半静态或流水式，以及曝气、承载量等。
②试验溶液配制方法，如果使用助溶剂，应注明使用浓度及对受试物的毒性影响。
③稀释用水，来源、类型、水质（pH、硬度、碱度和温度等）。
④试验容器，质地、规格、体积及清洗情况。
⑤试验溶液，体积、浓度、每个浓度组平行数，试验液跟更换情况、更换方法、流动情况，以及受试物的加入系统、流速、清洗周期及方法。受试物的规定浓度，实测浓度及测定日期。最好能用表格列出试验期间试验温度、pH 值、溶解氧的全部实测值。
⑥每一试验浓度的用鱼数目。
⑦光照，如光的性质、强度、周期。
4）试验报告：
①无死亡发生（EC0）的最高浓度。
②导致100%死亡（EC100）的最低浓度。
③24h、48h、72h、96h 时的每个浓度的累计死亡率。
④24h、48h、72h、96h 的LC50，及其95%的置信限。
⑤浓度—死亡率曲线图。
⑥确定LC50 值的统计学方法。
⑦对照组的死亡率。
⑧试验期间，可能会影响试验结果的隐患。
⑨鱼的异常反应。
5）结果讨论。
附录 D
（规范性文件）
细菌回复突变试验（鼠伤寒沙门氏菌法，简称：Ames 试验）
1.目的
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验是以微生物为指示生物的遗传毒理学体外试验，遗传学终点是基因突变，用于检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因碱基置换或移码突变。本方法规定了地表水和给谁的样品采集、预处理的方法和鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求。
2.原理
鼠伤寒沙门氏菌的标准试验菌株为组氨酸缺陷型突变型，在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。诱变剂（mutagen），又称为致突变剂或致突变物，可是沙门氏菌组氨酸缺陷突变型回复突变为野生型，在无组氨酸培养基上也能生长。故可根据在无组氨酸的培养基上生成的菌落数量，判断受试物是否为诱变剂。对于间接由编辑，可用经多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9 混合液作为代谢活化系统。
3.样品的采集
（1）仪器设备条件
采样瓶为棕色、大口玻璃瓶，瓶盖具聚四氟乙烯衬垫，或在样品无腐蚀性条件下使用具铝箔外衬的橡皮塞。
（2）样品采集
用采样瓶手工采集适量样品，地表水和废水样品要完全充满容器，密封，并于2h 内送至实验室，尽快进行处理。
4.地表水和废水样品预处理
（1）仪器设备条件
①分液漏斗。
②贮水器，具下口的玻璃容器。
③树脂柱玻璃管，高不低于10cm，柱管直径与柱长比为1：4~1：10 之间。
④输液泵。
⑤旋转蒸发器或KD 浓缩器。
⑥高纯氮气。
（2）试剂
①纯水：符合GB6682—1192 实验室用水规格。可用去离子水经全玻璃蒸馏器蒸馏制得。
②10mol/L 氢氧化钠溶液。
③（1：1）硫酸溶液。
④1mol/L 氢氧化钠溶液。
⑤1mol/L 盐酸溶液。
⑥二氯甲烷、甲醇、丙醇、正己烷，不低于分析纯级，应在玻璃容器中重蒸馏后方能使用。
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⑦二甲基亚砜（DMSO）。
⑧XAD-2 树脂或等效的大孔树脂：树脂应经纯水及甲醇漂洗后，在索氏提取器中分别用甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙醇提取8h，去除有机物。净化后的树脂浸于甲醇中，置4℃冰箱备用。
（3）样品制备
1）有机物的分离提取：
①有机物分离提取前的样品预处理，将采样瓶于4℃静置24h，使非水液相、水相、沉积固相分离。水相按下述原则处理：地表水中悬浮物的量低于5%时刻直接进行有机物的大孔树脂提取；悬浮物的量高于5%地表水及废水进行有机物的液-液提取。
②有机物的液-液提取：取二份1500ml 的水样分放到二个2000ml 分液漏斗中。用10mol/L氢氧化钠将pH 值调至11。向每个分液漏斗中加入150ml 二氯甲烷，振荡2min，注意放气。静置至少10min，使有机相与水相分层，分出有机相。再各用100ml 二氯甲烷提取二次。将三次提取液合并在1000ml 烧杯中。如有机相与水相建的乳化层多于溶剂层的1/3，可离心以达到两相的分层。用（1：1）硫酸溶液将水箱的pH 值调至2 以下。用二氯甲烷150ml、100ml、100ml 分三次进行溶剂提取。将这三次提取的有机相也并入1000ml 烧瓶中。