微生物菌剂使用环境安全评价导则（征求意见稿）

将肝匀浆在低温0~4℃高速离心机，12000r/min 离心10min。吸出上清液为S-9 组分，分装。保存于液氮或－80℃低温。S9 应经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry 法）及见解诱变剂鉴定其生物活性合格。
2）S-9 混合液的配制：
①0.4mol/L 氯化镁—1.65mol/L 氯化钾：称取MgCl2•6H2O 8.1g，KCl 12.3g 加蒸馏水稀释至100ml。0.103MPa 20min 灭菌或过滤除菌。
②0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4），每500ml 由以下组分组成：
磷酸氢二钠（Na2HPO4 14.2g/500ml） 440ml
磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O 13.8g/500ml） 60ml
调pH 值至7.4，0.103MPa 20min 灭菌或过滤除菌。
③10%S9 混合液的配制：每10ml 由以下成分组成，临用时配制。
灭菌蒸馏水 3.8ml
磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,pH7.4） 5.0ml
1.65mol/L 氯化钾-0.4mol/L 氯化镁溶液 0.2ml
葡萄糖-6-磷酸钠(MW305.9,0.05mol/L) 40μmol
辅酶(MW765.4,0.05mol/L) 50μmol
肝S9 液 1.0ml
混匀，置冰浴待用。在4℃以下，其活性可保存4-5h。当日使用，剩余的S-9 混合液废气 。
（4）受试生物
1）实验菌株：采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。TA97、TA98 可监测移码型诱变剂：TA100 可检测碱基置换型诱变剂：TA102 检测移码型和碱基置换型诱变剂。
2）增菌培养：取灭菌的25ml 三角烧瓶，加入营养肉汤10ml，从试验菌株母板上刮取少量细菌，接种至肉汤中。37℃振荡培养10h，存货细菌密度可达（1-2）×109/ml。
（5）菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定，以及对鉴别性诱变剂的反应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1）菌株基因型鉴定：
①组氨酸营养缺陷鉴定（组氨酸需求试验）：加热融化底层培养基量瓶各100ml。一瓶100ml 加L-盐酸组氨酸溶液（0.5g/100ml）1 和D-生物素溶液（0.5mmol/L）0.6ml；一瓶100ml 加D-生物素溶液（0.5mmol/L）0.6ml。充分混匀，待凉至50℃左右时各倒平皿四块，即分别为组氨酸-生物素平板和生物素平板。去组氨酸-生物素平板和生物素平板各一块，将试验菌株在此两组培养基上划线接种，经37℃培养24-48h，观察生长情况。此四种菌株应在组氨酸-生物素平板上生长，而在无组氨酸的生物平板上不能生长。
②深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验）：深粗糙型突变的细菌，缺失脂多糖屏障，因此分子量较大的物质能进入菌体。
鉴定方法：用移液器吸0.1%结晶紫溶液20，在肉汤平板表面涂成一条带，待结晶紫溶液干后，在与结晶紫带方向垂直化纤接种四种试验菌株。经37 培养24-48，观察生长情况。
此四种菌株在结晶紫溶液渗透区出现抑菌，证明试验菌株有rfa 突变。
③uvrB 缺失的鉴定（紫外线敏感试验）：uvrB 缺失即切除修复系统缺失。
鉴定方法：取受试菌液在营养肉汤琼脂平板上划线。用黑纸覆盖培养皿的一半，然后再15W 的紫外线灭菌灯下，距离33cm 照射8s。37℃培养24h。对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100）仅在没有照射过的一半生长，而菌株TA102 在没有照射过的一半和照射过的一般均能生长。
④R 因子和pAQ1 质粒的鉴定：四个试验标准菌株均带有R 因子，具有抗氨芐青霉素的特性。TA102 菌株含有pAQ1 质粒具有抗四环素的特性。
用结晶紫抑菌试验的方法，在二个肉汤平板上分别滴加氨芐青霉素溶液20μl（浓度为1mg/ml，溶于0.02mol/LNAOH）和四环素溶液20μ（l 浓度为0.08mg/ml,溶于0.02mol/L HCl）,并在肉汤平板表面涂成一条带，待溶液干后，垂直划线接种四种试验菌株。经37℃培养24-48h，观察生长情况。四个菌株生长应不受氨芐青霉素抑制，证明它们都带有R 因子。TA102菌株生长应不受四环素抑制，证明带有pAQ1 质粒。
2）自发回变数测定：取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管（2ml）,加入测试菌菌液0.1ml，迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基军训分布在底层上，平放固化。翻转平板于37℃培养48h，观察结果。计数回变菌落数。每株的自发回变率应落在表5-4-1 所列正常范围内。
3）对鉴别性诱变剂的反应：试验菌株对不同诱变剂的反应不同，应该在有合没有代谢活化的条件下鉴定个试验菌株对诱变剂的反应。可按下述的点试验或平皿掺入试验的方法进行。各试验菌株对鉴别型诱变剂的反应见表5-4-1 和表5-4-2。
表5-4-1 试验标准菌株生物学特性鉴定标准 

表5-4-2 鉴别性致突变物在点试中试验结果 

注：每皿或变菌落数（扣除自发回变）的符号：－＜20；＋20-100；＋＋100-200；＋＋＋200-500；＋＋＋＋＞500。柔毛霉素和叠氮钠溶解在水中，其他所有化合物溶解在DMSO中。ICR-191 为2-甲氧基-6-氯代-9-（3-（2-氯乙基）氨基丙胺）丫啶•2 盐酸。Inh 表示因毒性引起的生长抑制。