D.2.1.1.2用1~2层纱布过滤于500mL锥形量杯中,加水到近杯口。
D.2.1.1.3经1h后,倒去上液,另换清水,搅浑后,静置之,使其自然沉淀。
D.2.1.1.4半小时后,再弃去上清液,反复进行到上面的水接近无色和澄清。
D.2.1.1.5弃去上清液,将沉渣倒入量筒中,测定沉渣的容积。
D.2.1.1.6充分搅拌后,迅速用1mL玻璃吸管吸取沉渣0.1mL,放在载玻片上,加盖玻片(必要时可分成2片)。
D.2.1.1.7在低倍镜下检查,并作虫卵计数。
D.2.1.1.8反复检查10片后,算出每0.1mL沉渣中虫卵平均数。最后再计算单位容积粪稀中的钩虫卵数。
D.2.1.2浓缩法:亦可采用自然沉淀法和滤膜抽滤法。详见粪稀蛔虫卵检查法。
D.2.2钩虫幼虫的检查
D.2.2.1小试管培养法,操作如下:
D.2.2.1.1用剪刀把滤纸裁成9×1.5cm、边缘光滑的长纸条。
D.2.2.1.2于10×1cm的小试管中加入清水1~2mL。
D.2.2.1.3沿纸条长径,将滤纸左右对折,再摊平。
D.2.2.1.4用吸管吸取粪稀或其沉淀物,涂抹于纸条的中上段(面积约为4×1.3cm)。
D.2.2.1.5滤纸下面垫以吸水性强的粗草纸,以便吸去多余的水分。
D.2.2.1.6将涂有粪稀的纸条插入小试管中,下端浸入水里,而水又不接触粪稀。
D.2.2.1.7管口外面贴上样品号,并用纸包严,以防污染。
D.2.2.1.8把试管放置25~30℃恒温箱中培养。
D.2.2.1.9每天加水,防止干燥。
D.2.2.1.10培养5天后取出,在光线下用肉眼或放大镜,观察管底水中有否乳白色,呈蛇形状活动的钩蚴。或将管内水倒入平皿中。
D.2.2.1.11将45~48℃温水倒满试管中,静置20min,钳弃纸条,再静置沉淀半小时,倒去上层液体,把沉淀物倒入另一平皿内。
D.2.2.1.12用碘液杀死两个平皿中的钩蚴并使之染色。也可加入10%盐水,稍事沉淀,以杀死粪池中自由生活线虫。
D.2.2.1.13在显微镜下作钩蚴计数。
D.2.2.2双重平皿滤纸培养法,操作如下:
D.2.2.2.1取大小两个平皿,小的直径约6cm,大的直径约10cm,将小平皿的底及周围用滤纸包裹后,皿底朝上,口朝下,安放在大平皿的中央。
D.2.2.2.2称取粪稀约30g,经过水洗沉淀后,把含卵粪渣放在小平皿底的滤纸上,放在28℃恒温箱中培养。
D.2.2.2.3每日加水,防止滤纸干燥。
D.2.2.2.4三日后,在大平皿内加水。以后每天检查并加水,保持水深3~4mm。
D.2.2.2.55~7天后取出,于大平皿中滴加碘液,在解剖镜下,作钩蚴检查并计数。
钩虫、粪类圆线虫、东方毛圆线虫丝状蚴鉴别要点
附录E
粪稀中血吸虫卵检查法
(补充件)
粪稀血吸虫卵的检验,可以用沉淀法在显微镜下找虫卵,用孵化法找毛幼。
E.1沉淀法
操作方法如下:
E.1.1取粪稀样品约30g,放于烧杯或搪瓷杯中,加水调成糊状。
E.1.2通过40~60目铜丝筛,滤入500mL锥形量杯中,加水近满。
E.1.3静置20~30min后,待沉渣沉淀,倒去上层粪水,保留沉渣约30mL,换加清水至原刻度处。以后每隔20~30min,换水一次。直到上浮液澄清为止。因为血吸虫卵必须入水才能孵化。而且在清水中较易孵化,所以粪稀必须冲洗至上浮液澄清为止。
E.1.4经3~4次换水后,用玻璃吸管吸取沉渣,作成涂片,镜检有无血吸虫卵。图片的面积约占玻片面积的2/3,其厚度以能透过涂片看清报纸上的印刷字体为标准,过厚时可加清水1~2滴稀释之。
E.1.5一般要求每份粪稀,至少观察3张涂片,每张图片观察时要有规律,镜检时间应不少于2min,仔细分清血吸虫卵和其他蠕虫卵,并与粪稀中常见的异物,如植物细胞等相区别。
E.1.6如连续镜检沉渣涂片三张,未发现有血吸虫卵时,将全部沉渣倒入250mL三角烧瓶(作为孵化瓶)中,加水近满,进行孵化。
E.2孵化法
孵化法是依据血吸虫卵内的毛蚴在适宜条件下很快孵出,并游动于水表面下的特性。方法如下:
E.2.1取约30g粪稀样品,先经沉淀法浓集处理,继将处理的粪稀沉渣倒入250mL三角烧瓶内,加入清水至瓶口。城市中需用去氯水,或把自来水放置过夜,促其自然脱氯,或在水中加入少量硫代硫酸钠(每40kg水中,加入10%硫代硫酸钠溶液1mL)以除去余氯。在无自来水的地区,用河水或井水作为孵化用水时,将水加温到70~80℃,待冷后再用,以免与水中原生动物相混淆,影响观察。
E.2.2置20~30C下进行孵化。毛蚴孵化最适宜的温度为25~30℃,如在10℃以下或37℃以上,则毛蚴不能孵出。孵化所需的时间,30℃以上,1~3h;25~30℃,4~6h;25℃以下,需过夜,气温在15℃以下时,40h左右。故在4、12和24h后,用肉眼或放大镜观察一次。观察时,眼齐孵化瓶口,对着光,瓶后衬以黑色纸作背景,检查近瓶口1~3cm处,如见水面下有白色点状物,作直线来往游动,遇到阻碍时,立即转变方向者,即是毛蚴,但需与水中一些原生动物如草履虫等相区别。草履虫的运动,呈螺旋样摇摆或滚动,必要时可用吸管将毛蚴吸出,在显微镜下鉴别。
注意:气温高时毛蚴迅速孵出,在自然气温25℃以上的季节,毛蚴有在沉淀过程中孵出而随换水被倒去的可能,因此应严格掌握换水的时间,以免因换水倒去毛蚴。在这种情况下,可用1~1.2%食盐水代替清水作沉淀,暂时抑制毛蚴孵出,而在更后一次沉淀时,再换清水进行孵化。