注:有时从现场采得的堆肥样品,多属未腐烂的蔬菜帮子、瓜果皮核和草梗等,难以筛出土粒状物。在此情况下,可把一定量的混合均匀样品,用剪子稍事剪小后,清水浸泡,继将洗液静置沉淀,而后收集沉淀物备检。
B.1.4将经过处理的样品装于适当大小的广口瓶中,贴上标签。
注:经上述混合均匀而又有代表性的许多份堆肥样品,如一时未能全部检验完毕,则需滴加一些防腐剂如3%福尔马林溶液,或3%盐酸溶液,加盖后,放置冰箱中,目的在于防止原生动物和霉菌的繁殖,影响观察,和避免活的蛔虫卵进一步发育,难以了解采样当时的发育情况。
B.2堆肥样品显微镜检查
检验堆肥蛔虫卵的原理,是先用碱性溶液和已经处理过的堆肥样品充分混合,分离蛔虫卵,继用比重较蛔虫卵比重大的溶液为漂浮液,使蛔虫卵漂浮在溶液的表面,从而收集检验之,或加入清水,因蛔虫卵的比重大于水的比重,使蛔虫卵沉在水底,从中吸取蛔虫卵检验之。
B.2.1漂浮法:所用的为饱和硝酸钠溶液离心漂浮法,操作步骤类似土壤蛔虫卵检查法:
B.2.1.1分离:称取5~10g经过处理的堆肥样品于容量50mL清洁铜离心管或塑料离心管中。注入5%氢氧化钠溶液25~30mL,另加玻璃珠约10粒,用适当大小的橡皮塞子紧塞管口,置电动振荡机上,振荡10~15min,每分钟200~300次,静置15~30min后,再行振荡,如此重复3~4次,使堆肥样品为碱性溶液所浸透,加上玻璃珠的撞击和摩擦,则混合液中的蛔虫卵,不再被粘着在一起。
B.2.1.2漂浮:从振荡机上取下离心管,揭去橡皮塞子,用滴管吸取清水,将附着在皮塞上和管口内壁的泥状物,冲入管中,以免一小部分虫卵的漏检。而后再在离心机上离心3~5min,每分钟2000~2500转。倒去多余的氢氧化钠溶液,水洗一次,即加清水将沉淀物搅浑后,离心,倒去上面的脏水。随后加入少量饱和硝酸钠溶液(比重1.38~1.40),用玻璃棒搅成糊状后,徐徐添加饱和硝酸钠溶液,随加随搅,直加到离管口约1cm为止,此时将附在玻棒上的混合液也用一两滴饱和硝酸钠溶液,冲入管中,离心3~5min,每分钟2000~2500转,由于蛔虫卵的比重小于饱和硝酸钠溶液的比重,因此经离心后,管中的蛔虫卵,就会漂浮在硝酸钠溶液的表面。
B.2.1.3移置液膜:用直径略小于1cm的金属丝圈(状如细菌学上所用的接种环)不断将表层液膜移于盛有半杯清水的小烧杯中,约30次后,再次搅拌和离心,适当增加一些饱和硝酸钠溶液,如此反复操作3~4次,直到液膜涂片未查见虫卵为止。
B.2.1.4抽滤:将烧杯中含卵混悬液,通过高尔特曼氏漏斗,抽滤于直径35mm,无裂纹和孔眼的微孔火棉胶滤膜上(孔径0.65~0.80μm),混合悬液中的蛔虫卵,全部阻留在微孔滤膜上。有时由于样品中蛔虫卵数量过多,浑浊度大,不易为一张滤膜所滤过时,则可另添一或二张滤膜。
B.2.1.5镜检:抽滤完毕,立即用眼科弯头小镊子,将滤膜从漏斗的滤台上小心取下,平铺于4×7.5cm的大型载物玻璃片上,趁湿在低倍显微镜下直接检查,最好滴加两三滴50%甘油溶液,这样,蛔虫卵在比较透明而无气泡的视野中,便于观察和计数。
B.2.2沉淀法:水洗离心沉淀法,操作步骤如下:
B.2.2.1水洗:称取100g经过处理的堆肥样品或一定量经过剪小的蔬菜帮子等有机堆肥的浸出沉淀物,放在500mL三角烧瓶中,加入5%氢氧化钠溶液100~150mL和三、四十粒玻璃珠,塞以橡皮塞。浸泡半小时后,振摇3~4min,将上面的液体,倒入大烧杯中,再加等量清水于三角烧瓶中,浸洗三、四次,直到洗出液透明为止。
B.2.2.2过滤并水洗沉淀:将前后收集的洗液,用1~2层纱布过滤于1000mL锥形量杯中,静置半小时至一小时后,倒去上层液体,如此,约半小时换水一次,直至上层水澄清为止。
B.2.2.3测定体积:用虹吸管慢慢吸去沉淀上面的液体,将沉淀物倒入刻度量筒中,测量沉淀物的容积。
B.2.2.4镜检:将沉淀物搅浑,搅匀,迅速用1mL玻璃吸管吸取0.05和0.1mL于载玻片,盖以盖玻片(依盖玻片的大小,分别对2或3、4片不等)在低倍镜下检查并计数。
B.3堆肥蛔虫卵数量测定法
堆肥中含有的蛔虫卵数,往往较多,用饱和硝酸钠溶液离心漂浮法时,5~10g样品中的蛔虫卵,高度集中在滤膜上,在显微镜下计数时容易混乱,因此,最好能在显微镜的目镜筒内,装上一枚目镜计数网,利用移动尺有规律的移动,逐渐数完整个滤膜上的全部蛔虫卵数。例如500g有代表性的原始堆肥样品,经挑去夹杂物并过筛后,得184g,其中的10g用饱和硝酸钠溶液离心漂浮后,在滤膜上数得蛔虫卵数为350个,则350/10×184=6440个。实际上,184g的含有数,亦即代表500g原始堆肥所含有的蛔虫卵数。
在用水洗沉淀法时,需要准确测定沉淀物的容积,在用玻璃吸管吸取沉淀以供镜检时,必须搅拌均匀而后取样,而且需要连续观察若干次,而后取其平均数,从而计算1mL沉淀物的虫卵数,最后乘以沉淀总容积数,便是100g原始堆肥样品的虫卵数。
B.4堆肥蛔虫卵生活力测定法
目前测定堆肥蛔虫卵生活力所用的方法,除了采用简单易行的直接镜检法外,普遍采用培养法,而染色法则因操作较为复杂,不如直接镜检法简便,效果不如培养法的可靠,因为未普遍采用。
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