B.4.1直接镜检法:是根据蛔虫卵在发育过程中所出现的各种形态,以鉴别其死活。首先是鉴别受精卵和未受精卵,其次是鉴别有生活力和失去生活力(变性卵)的受精卵和含有幼虫卵的形态。
采用直接镜检法时,有关形态鉴别要点如下:
B.4.1.1未受精蛔虫卵的形态:多为长椭圆形,有时呈三菱形或不规则形,大小平均为80~98×40~60μm,一般为黄褐色,有时蛋白质壳发育不全,有时完全失去蛋白质壳,卵内经常充满大大小小油滴状的卵黄细胞。
B.4.1.2受精蛔虫卵的形态:
活的受精蛔虫卵的形态:蛋白质壳为黄褐色,脱去蛋白质壳的为无色透明;平均大小为50~70×40~50μm;外层卵壳厚,内层壳薄,有屈光性,最外层的蛋白质壳也很厚,呈乳状或花纹状突起;卵内有一个球形的卵细胞,卵壳两端和卵细胞之间,有半月形的空隙,卵内的卵黄颗粒清晰而致密。
死受精蛔虫卵(变性卵)的形态:
卵细胞移向一端,致使卵壳两端呈现有大小不等的半月形空隙。
卵内脂肪变性,形成空泡,很像未受精卵,高温堆肥样品中卵内的空泡尤为显著。
卵细胞颗粒减少或消失。
卵细胞质浑浊,呈黑色或棕黑色。
卵细胞向不定部位呈球状收缩。
卵壳的一侧或两侧,一端或两端向内凹陷或破裂。
只有蛋白质壳,而缺内容物。
B.4.1.3含有活幼虫卵的形态:
虫体的前后部没有颗粒,中部颗粒清晰而有金属光泽,有立体感,镜检时,注视或轻压,可见有轻微蠕动,强压后,有时可挤出幼虫。
B.4.1.4含有死幼虫卵的形态:
幼虫体内几乎充满颗粒,且模糊不清,无金属光泽,缺乏立体感,镜检时注视之,久久不见蠕动,稍稍加热或轻压,不会蠕动;强压时,虽能挤出幼虫,但也不改变其原来的卷曲状态。
以上所列是死活蛔虫卵的一般形态,在镜检中有时会遇到外形发生变化的畸形活卵和各种形态的未受精卵,以及容易误认为寄生虫卵的异物。
B.4.2滤膜培养法:把上述通过饱和硝酸钠溶液离心漂浮后收集在滤膜上的蛔虫卵,经过计数后,直接用来培养,称为滤膜培养法。
滤膜培养法测定蛔虫卵生活力的操作步骤如下:
B.4.2.1在直径10~12Cm的玻璃平皿的底部平铺一层厚约1cm的脱脂棉(或微孔塑料),脱脂棉上铺一张直径与平皿等大的普通滤纸。
B.4.2.2为防止霉菌和原生动物的繁殖,可加入2~3%甲醛溶液或甲醛生理盐水,以湿透滤纸和脱脂棉。
B.4.2.3把含卵滤膜平铺在皿中滤纸上,加盖,并在皿盖上编号。一个平皿可同时放上几张滤膜,互不接触。
B.4.2.4把平皿放在24~26℃的恒温箱中培养一个月,培养过程中经常滴加清水或2~3%的甲醛溶液,使滤膜保持潮湿状态。
注:堆肥样品中的蛔虫卵,因受温度的影响,死卵的形态变化比较显著,往往培养不到一个月,即能明确判定为死卵,无需继续培养。
B.4.2.5培养一个月后自皿中取出滤膜置于载玻片上,滴加50%甘油溶液,使其透明后,在低倍镜下查找蛔虫卵,然后在高倍镜下,根据形态,鉴定卵的死活,并加以计数。镜检时有时会感到视野的亮度和滤膜的透明度不够理想,则可在一张载物片上,滴一滴清水,另用一张盖玻片从滤膜上刮下少许含卵滤渣,与水混合搅匀,盖上同一盖玻片进行镜检,或是在载玻片上滴1~2小滴30%安替福尼液代替清水,蛔虫卵外面的蛋白质壳很快被溶解掉,内部构造便于观察。凡含有幼虫的,都认为是活卵,其他阶段的或单细胞的,都判为是死卵。
附录C
粪稀蛔虫卵检查法
(补充件)
C.1样品处理
自密闭化粪池或沼气发酵池等不同类型的粪池中采集的粪稀样品,因为是分别采自进出料口以及上下不同的层次,所以样品有稀有稠,稀者状如水样,稠者形若污泥和新鲜粪便。样品送到实验室后,不论稀稠,均应尽快倒于适当大小的玻璃容器内,加以搅拌均匀,而且在搅拌的同时,用镊子挑去浮在上面的或混在其中肉眼所能看到的夹杂物。
C.2粪稀样品显微镜检查
粪稀样品经过如上的处理后,进一步进行蛔虫卵的检验工作,包括定量检验蛔虫卵的数量测定和定性检验(蛔虫卵生活力的测定)。
C.2.1粪稀蛔虫卵数量测定法
沼气池等进料口的样品,因为稠度较大,适于采用稀释法。而出料口的样品,由于较稀,则以采用浓缩法为佳。
C.2.1.1稀释法:采用的有两种方法,即滤膜法和司徒氏法。
C.2.1.1.1滤膜抽滤稀释计数法操作步骤如下:
C.2.1.1.1.1取混匀的进料口粪稀100mL,加水稀释至300~500mL。
C.2.1.1.1.2用60孔的金属筛子过滤于500mL锥形量杯中,静置30min。
C.2.1.1.1.3倒去沉淀上部的液体,将沉渣移入50mL离心管中,离心3min,每分钟2000转。
C.2.1.1.1.4倒去上清液,加入20mL5%氢氧化钠溶液或30%安替福尼溶液。
C.2.1.1.1.5每隔10min用玻璃棒搅拌均匀,以促进蛔虫卵和杂质的分离。
C.2.1.1.1.61h后,加水近满,经搅拌后,离心3min后,弃去上部碱性溶液。
C.2.1.1.1.7加入饱和硝酸钠溶液或饱和食盐水,搅拌后,离心3~5min,每分钟2000~2500转。