8.2试样稀释
8.2.1以无菌操作，吸取经充分混匀的试样10ml于盛有90ml灭菌生理盐水的稀释瓶(8.1.3)中．充分混匀后就成1：10的稀释液。
8.2.2吸取1：10稀释液lml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：100的稀释液。
8.2.3按上述操作进行10倍递增稀释，每递增稀释1次，随即换用1支lml灭菌刻度吸管。6.3发酵试验
以无菌操作，选择适宜的四个连续稀释试样1ml，接种到各装有l0ml乳糖蛋自胨培养液（5.1）的试管（内有倒管）中，若其中取10ml原试样，则需注入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（5.2）即的试管（内有倒管）中，混匀后置于(36士1)℃的恒温培养箱内培养(24±2)h。
8.4平板分离培养
取出经培养24h后的发酵试管，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠平板培养基(5.3.3)或伊红美蓝平板培养基(5.4.3)上，再置于(36±1)℃恒温培养箱内培养18～24h。挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一半进行涂片、革兰氏染色、镜检（见附录A）。
品红亚硫酸钠培养基上的菌数：
紫红色，具有金属光泽的菌落；
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色，中心色较深的菌落。
伊红美蓝培养基上的菌落：
深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色，中心色较深的菌落。
8.5证实试验
上述涂片、镜检的菌落，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一半再接种于装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养液(5.1)的试管（内有倒管）中，然后置于(36±1)℃恒温培养箱中培养(24±2)h。有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
9、报告方式
根据证实试验由大肠菌群存在的阳性管数，查MPN检索表（表1），MPN值在100以内时，按其实际取值表示，大于100时，用10的指数形式表示，并以每升渗沥液水样品中的总大肠菌群的MPN值报告。
10、本标准未作规定的按GB5750和GB4789.3执行。
附录A
革兰氏染色和镜检
（补充件）
A1革兰氏染色
A1.1染色液配制
A1.1.1结晶紫染色液
结晶紫1.0g
95％乙醇20.0mL
1％草酸铵水溶液80.0mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸按溶液混合。
结晶紫溶液放置过久产生沉淀，不能再用。
A1.1.2碘助染液
碘1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300.0ml
将碘和碘化钾先行混合，加少许蒸馏水充分振摇，待完全溶解后，再用蒸馏水稀释至300ml。此溶液二星期内有效。当溶液由棕黄色变成淡黄色时，即应弃去。
A1.1.3乙醇脱色液，95％(V/V)乙醇。
A1.1.4沙黄复染液
沙黄0.25g
95％乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
将沙黄溶于乙醇中，待完全溶解后，加入90mL蒸馏水。
A1.2染色步骤
A1.2.1涂片
用灼烧冷却后的接种环挑一环2％生理盐水于清洁无脂的载玻片上，再用接种环从培养18～24h符合菌落特征的平板中取菌落的一半沾于盐水滴的上端，烧去接种环上多余的菌落。然后用接种环将菌种在盐水中均匀涂开，要涂得薄些（形成可见的薄层），然后将标本向上，在火焰上方加温固定，于燥、冷却。
A1.2.2染色
滴加结晶紫染色液，染色1min，倾去染色液，水洗。
滴加碘助染液，作用1min后倾去，水洗。
滴加乙醇脱色液，摇动载玻片，直至无紫色脱落为止（约30s），水洗。
滴加沙黄复染液，染色1min后倾去，水洗。
晾干，镜检。
A2镜检
滴香柏油，在高倍油镜下观察，呈深紫色为革兰氏阳性菌，呈淡红色为革兰氏阴性菌。
附加说明：
本标准由建设部标准定额研究所提出。
本标准由建设部城镇环境卫生技术标准归口单位上海市环境卫生管理局归口。
本标准由上海市环境卫生设计科研所负责起草。
本标准主要起草人：庄启化、张莉娜。
本标准委托上海市环境卫生设计研究所负责解释。
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