生活垃圾渗沥水总大肠菌群的检测 多管发酵法 CJ/T3018.15-1993

生活垃圾渗沥水总大肠菌群的检测 多管发酵法
Leachate-Detection for members of the coliform group-Multiple-tube fermentation method
CJ/T3018.15-1993
1、主题内容与适用范围
本标准规定了用多管发酵法检测渗沥水中总大肠菌群的方法。
本标准适用于从生活垃圾中渗出来的液体。
2、引用标准
GB5750生活饮用水标准检验法总大肠菌群
GB4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
3、术语
总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
总大肠菌群数系以每升渗沥水样品内，总大肠菌群的最可能数(MPN)表示。
4、原理
根据总大肠菌群具有的生物特征，如革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃于乳糖内培养能发酵，并在24h内产酸、产气的特点，将不同稀释度的试样接种到具有选择性的乳糖培养基中，经培养后根据阳性反应结果，测出原试样中总大肠菌群的MPN值。
5、培养基和试剂
本标准所用试剂出另有说明外，均为符合国家标准或行业标准的化学纯试剂和生化试剂，均用蒸馏水或去离子水。
5.1乳糖蛋白胨培养液
5.1.1成分：蛋白胨10g
牛肉膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6％溴甲酚紫乙醇1ml
蒸馏水1000ml
5.1.2制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于100oml蒸馏水中加热溶解，调整pH为7.2～7.4，在加入1mll.6％嗅甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
5.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述乳糖蛋白胨培养液(5.1)浓缩三倍配制。
5.3品红亚硫酸钠培养基
5.3.1成份：蛋白胨10g
乳糖l0g
磷酸氢二钾3.5g
琼脂15～30g
蒸馏水1000mL
无水亚硫酸钠～5g
5％碱性品红乙醇溶液20mL
5.3.2储备培养基的制备
先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使其溶解。再用蒸馏水补足到1000mL，调整pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃灭菌20min,贮存于冷暗处备用。
5.3.3平板培养基的配制
将上法制备的储备培养基（5.3.2）加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存应小于两星期，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
5.4伊红美蓝培养基
5.4.1成分：蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾琼脂20g
蒸馏水1000ml
2％伊红水溶液20ml
0.5％美蓝水溶液13ml
5.4.2储备培养基的制备
先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再用蒸馏水补足到1000ml，调整pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115℃灭菌20min,贮存于冷暗处备用。
5.4.3平板培养基的配制
将上法制备的储备培养基(5.4.2)加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别取一定量已灭菌的2％伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置箱内备用。
5.5生理盐水
将（8.50～9.50）g氯化钠(NaCl)溶于水中，稀释成1000ml摇匀。pH值应为4.5～7.0。
6、仪器、设备
6.1高压蒸汽灭菌器。
6.2干燥箱：最高工作温度300℃。
6.3恒温培养箱：（36士1）℃。
6.4冰箱。
6.5恒温水浴：(46士1)℃。
6.6生物显微镜。
6.7稀释瓶:125mL小口玻璃方瓶。
6.8玻璃试管：（18×180）mm。
6.9玻璃倒管：（3×30）mm
6.10刻度吸管：1ml，10ml，分度至0.1ml。
6.11载玻片。
6.12平皿：直径90mm。
6.13接种环：直径3mm。
6.14酒精灯。
7、样品
供总大肠菌群检测的渗沥水实验室样品量约需100mL,用经灭菌处理过的玻璃瓶采集。采样后应尽快检测，在2h内不能处理时，应置于2～5℃冷藏，最长保存时间为6h,
8、步骤
8.1准备工作
8.1.1工作室及操作台经清扫后，用紫外线灭菌10min。
8.1.2玻璃器皿置于干燥箱中于160℃灭菌2h。
8.1.3将装有90mL生理盐水的稀释瓶和9mL生理盐水的试管，前者瓶口橡皮塞衬上滤纸条，后者管口塞上棉花球，置高压蒸汽灭菌器(6.1)内，于121℃灭菌20min，冷却待用。